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Cuaderno Nº 28  

Elaboración de una planta transgénica: Técnica de Biobalística
  Como se explicó en el Cuaderno Nº 18 las técnicas de ingeniería genética y el uso de nuevos conocimientos científicos permiten modificar los organismos mediante intervenciones precisas, rápidas y controladas. Incluso, es posible transferir a las plantas información genética de organismos no emparentados. En la actualidad esta metodología es aplicada rutinariamente y son muchos los esfuerzos y los recursos que se invierten con el objetivo de optimizar las técnicas para trasladarlas a diferentes especies vegetales. La transformación genética ha sido adoptada como un método para mejorar o introducir nuevas características, y para entender el funcionamiento de las plantas.

Métodos de transformación genética

La transformación de plantas depende de la introducción estable de los transgenes dentro del genoma vegetal. Con el objeto de hacer más fácil y eficiente la transferencia de ADN hacia células o tejidos vegetales, se han desarrollado diferentes métodos de transformación genética, que se pueden dividir en dos clases de acuerdo con el mecanismo utilizado para la transferencia:

1.métodos basados en la utilización de vectores biológicos, como Agrobacterium tumefaciens o  virus vegetales;
 
2.métodos que consisten en la transferencia directa de ADN, como el de biobalística.

Si bien en la actualidad es posible obtener plantas transgénicas de diferentes especies con Agrobacterium, el rango natural de hospedantes de la bacteria se constituyó en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no eran susceptibles a la misma. En consecuencia, se desarrollaron métodos alternativos de transferencia directa de ADN basados en procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica, o mecánica. Estos nuevos métodos, permiten transferir ADN desnudo (sin mediación de vectores biológicos), y el más ampliamente utilizado en la transformación genética de plantas es el “bombardeo con micropartículas” también conocido como biobalística. El desarrollo de este método tuvo grandes implicancias en lo que se refiere al mejoramiento genético de plantas de interés agronómico como arroz, maíz o soja, que hasta entonces no se habían podido transformar con Agrobacterium.  

¿Qué es la Biobalística?


El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la década de 1980
por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula. En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de partículas microscópicas (micropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografía 1 y 2 , respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las micropartículas puedan atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2 ), o por una descarga eléctrica de una gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las micropartículas debido a las modificaciones del entorno iónico.

Micropartículas de oro (1) y tungsteno (2)

Microcañón con partículas metálicas rodeadas de ADN. 
Fuente:
http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm

Si las partículas atraviesan las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como transformación estable. La transformación estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de selección in vitro (ver cuadernos Nº 5, 18 y 67) que permita distinguir células transformadas y no transformadas.

En este método de transformación las construcciones genéticas son más simples e incluyen los genes de interés y de selección con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plásmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las células, o bien de forma de molécula lineal (el plásmido cortado en un punto), a diferencia de los plásmidos utilizados con Agrobacterium (plásmido ti desarmado). También es muy común que una vez obtenida la construcción genética dentro de un plásmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para sólo tener la secuencia con los genes de interés y de selección (incluidas las secuencias regulatorias) y así reducir el fragmento de ADN a transferir. 

Un poco de historia
El primer cañón génico desarrollado operaba de forma similar a una pistola, en la que una bala de plástico acelerada por explosión de pólvora liberaba una salva de micropartículas metálicas revestidas de ADN.
Como se muestra en el esquema, luego del impacto, la bala quedaba retenida en el extremo del tubo de aceleración y las micropartículas eran impulsadas hacia el tejido blanco a través de un orificio existente en la placa.

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La primera demostración de que el sistema funcionaba se realizó en 1987 al introducir ADN en células epidérmicas de cebolla. Poco después, el método fue probado en diferentes organismos con éxito. Así el método de bombardeo de
micropartículas se constituyó en el segundo método de transformación genética de plantas más empleado, luego del de Agrobacterium.
Posteriormente este cañón génico fue modificado y se reemplazó la carga de pólvora por presión de gas para generar el impulso de las micropartículas. El modelo más utilizado en la actualidad es el cañón de alta presión de helio PDS-1000/He®, registrado como sistema biobalístico por Dupont.
Este cañón consta de una cámara principal en donde se bombardea el tejido blanco en condiciones de vacío parcial. El helio comprimido es liberado a gran velocidad hacia la cámara, e impulsa una membrana de plástico que lleva las micropartículas recubiertas de ADN, las cuales son así aceleradas hacia el tejido blanco.

Fuente : www.biorad.com

En 1996 se empezó a utilizar una pistola génica de mano como alternativa al cañón PDS 1000/He. Este dispositivo permite trabajar sin vacío con virtualmente cualquier tipo de células o tejido blanco. Además puede utilizarse para realizar estudios en organismos vivos.

Fuente: http://science.marshall.edu/harrison/research.html

¿Cuáles son las aplicaciones de la Biobalística?

El bombardeo de micropartículas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza física, permite introducir ADN (sin necesidad de vectores) en cualquier tipo de tejido o célula. Ha sido utilizado para introducir y expresar material genético no sólo en plantas sino también en bacterias, protozoarios, algas, hongos, células y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos) y aún animales y plantas in vivo. Al elegir un tejido blanco para la transformación por biobalística debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de interés para regenerar in vitro. Entre los explantos vegetales utilizados con mayor éxito, se encuentran las hojas, suspensiones celulares, meristemas, embriones, primordios foliares, cotiledones y callos (ver cuaderno Nº35 y 56). Además en la actualidad, constituye el único medio que permite transformar organelas celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible. Este método a su vez es sumamente útil para analizar la función y regulación génica, transferir ARN viral y estudiar vías metabólicas.
Los logros más destacados en la generación de plantas transgénicas por medio de este método, incluyen especies de gran importancia económica como son la soja, el maíz, el arroz, el sorgo, la papaya, la caña de azúcar, el trigo y el espárrago.
 
 

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