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Cuaderno Nº 18  

Elaboración de una planta transgénica: Técnica de Agrobacterium tumefaciens
 

Una de las variables que contribuye a aumentar la productividad agrícola es el mejoramiento genético de los cultivos, ya sea mediante métodos convencionales o por técnicas de ingeniería genética (ver Cuaderno Nº 4 y Nº 5). Las técnicas de ingeniería genética y el uso de nuevos conocimientos científicos permiten modificar los organismos mediante intervenciones precisas, rápidas y predictivas.
Además, con el desarrollo de la metodología de cultivo de tejidos y de la ingeniería genética se ampliaron considerablemente los límites de disponibilidad de genes impuestos por la incompatibilidad sexual en el mejoramiento convencional de plantas. Es decir que mediante ingeniería genética es posible transferir a las plantas información genética de organismos no emparentados. En la actualidad esta metodología es aplicada rutinariamente y son muchos los esfuerzos y los recursos que se invierten con el objetivo de optimizar la técnica para trasladarla a diferentes especies vegetales.
Hasta el momento no sólo se han obtenido variedades transgénicas de cultivos agronómicos como maíz o soja, sino también de otras especies vegetales con el fin de usarlas por ejemplo en la biorremediación de ambientes degradados, en la producción de vacunas, o para la obtención de bioplásticos o de biocombustibles, entre otros desarrollos (ver Cuadernos Nº 46, 48, 58 y 74).   
    
¿Cómo se modifica una planta por ingeniería genética?
La transformación genética de plantas consiste en la transferencia de material genético proveniente del mismo u otro organismo. En general, involucra el cultivo de células o tejidos in vitro, dado que la transferencia de genes se realiza a algunas células del organismo que se quiere transformar. A partir de estas células se regeneran plantas completas, que llevan los genes transferidos, los expresan y los transmiten a la descendencia. Las plantas transgénicas así obtenidas son incluidas luego en planes de mejoramiento tradicional a través de cruzamientos (reproducción sexual) para transferir los genes de interés a variedades de alto rendimiento.
Mientras una gran variedad de estrategias de regeneración y transformación son aplicables a muchos cultivos, algunas veces se requieren protocolos (recetas) muy particulares y específicos. Por lo tanto, antes de elegir un sistema de transformación
vegetal, se requiere establecer una metodología rápida y eficiente de cultivo in vitro que permita regenerar plantas completas y fértiles de la especie de interés.

Métodos de transformación de plantas

Diferentes sistemas de transformación de plantas han sido desarrollados con el objeto de hacer más fácil y eficiente esta metodología. Estos métodos se dividen en:
a)Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens:  un vector biológico que participa de la transferencia;
 
b)Métodos de transformación genética directos: por distintos mecanismos físicos se introduce el ADN en la célula (ver cuaderno Nº 19).

Construcción de un vector

En las técnicas de transformación es necesario disponer del gen de interés dentro de un vector (vehículo) apropiado para ser transferido al tejido que se quiere transformar. Este vector es generalmente un plásmido (porción de ADN circular relativamente pequeño que puede mantenerse en el citoplasma de una bacteria u otro tipo celular) al que se le inserta el gen de interés (ver Cuaderno Nº 67). Otro punto esencial es el establecimiento de un sistema que permita identificar las células o tejidos transformados. Para esto, en el segmento de ADN que se va a transferir se agrega junto al gen de interés un gen auxiliar llamado gen de selección.



El gen que va a ser transferido o transgén está compuesto por una secuencia codificante (el gen de interés) y por secuencias regulatorias. Las secuencias regulatorias son los promotores (P) que determinan el momento, lugar y nivel de expresión de cada gen y los terminadores (T), que indican la terminación de la transcripción (proceso que interviene en la expresión del gen).

El gen de selección, en general, confiere a las células transgénicas que lo expresan una ventaja con respecto a las células no transgénicas, como por ejemplo resistencia a un antibiótico o herbicida. De esta forma aquellas células o tejidos que hayan recibido el gen de selección sobrevivirán en un medio de cultivo que contenga además de los nutrientes necesarios el agente selector (antibiótico o herbicida), mientras que las no transgénicas no sobrevivirán. Al seleccionar células resistentes al agente selector (por ej. herbicida) se tiene una evidencia indirecta de que el gen de interés ha sido transferido. Esto es importante ya que mediante el uso de un sistema de selección en las primeras etapas es posible evidenciar tempranamente la eficiencia de la metodología de transformación y acotar el trabajo de cultivo de tejidos a las células que sean seleccionadas como transgénicas, con un importante ahorro en costo y mano de obra. En etapas más avanzadas, es posible comprobar la integración al genoma vegetal y la expresión del gen de interés mediante diferentes técnicas moleculares (ver Cuaderno Nº 67).

Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero genético por naturaleza

El método más difundido para la transformación genética de plantas se basa en un proceso mediado por Agrobacterium tumefaciens, una bacteria que vive en el suelo e infecta a un amplio rango de plantas. Esta bacteria tiene como blanco de infección a las heridas en el tallo o raíces de la planta inmediatamente sobre el nivel del suelo, donde ataca a las células, causando su proliferación y formación de tumores. Esta enfermedad se conoce como “agalla de la corona”

 

 

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El desarrollo de los tumores se debe a que Agrobacterium tiene la capacidad de transferir parte de su propio material genético a la planta hospedante. La capacidad patogénica de esta bacteria se asocia a la presencia de plásmidos Ti (inductor de tumor). Se ha demostrado que un fragmento de estos plásmidos, llamado ADN-T (ADN de transferencia), es transferido a la célula vegetal donde se integra al ADN cromosómico de la planta. La transferencia de ADN es inducida por la expresión de unos genes llamados vir que se encuentran en el plásmido Ti por fuera de la secuencia que se transfiere. Dentro del ADN-T se encuentran genes bacterianos que intervienen en la síntesis de fitohormonas (hormonas vegetales) que causan la proliferación celular. También genes que participan de la síntesis de una serie de compuestos denominados opinas, los que son secretados y utilizados como nutrientes por Agrobacterium. De esta forma la bacteria redirige genéticamente el metabolismo de la planta para su propio beneficio.


Transformación vegetal mediada por Agrobacterium tumefaciens

El mecanismo natural de ingeniería genética utilizado por Agrobacterium para transferir parte de su ADN a las células vegetales, es aprovechado por los investigadores para transferir genes de interés a las plantas.
Para ello, primero los científicos trabajan con el plásmido Ti, en el cual reemplazan la secuencia original de ADN-T que porta los genes responsables de la formación de tumores y los genes de síntesis de opinas, por otra secuencia nueva con el gen de interés y algún gen de selección (de antibióticos o herbicidas).


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Los bordes derecho e izquierdo son necesarios para dirigir el procesamiento del ADN-T. Cualquier fragmento de ADN ubicado entre estos bordes puede ser transferido a la célula vegetal.

Luego, el plásmido obtenido llevando el transgén (sin las secuencias patogénicas), se transfiere a células de Agrobacterium. Así, la bacteria portando el nuevo plásmido es utilizada para transformar células vegetales.

Dentro del plásmido Ti existe una zona donde se encuentran los genes vir que son responsables del procesamiento, corte y transferencia del ADN-T. 

La transformación de la planta se induce a partir del contacto entre la bacteria que porta el gen de interés en su plásmido y las células vegetales (por ej. hojas, cotiledones, etc.). El ADN-T es transportado desde la célula bacteriana a la célula vegetal donde se integra a su material genético. Luego de la transformación, el tejido vegetal es cultivado in vitro en un medio con un agente selector (antibióticos o herbicidas) donde sólo las células transgénicas sobreviven.

 

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Las células vegetales son totipotentes, quiere decir que una célula de cualquier parte de la planta puede multiplicarse y generar la planta completa. Para eso las células deben crecer en el medio de cultivo adecuado y en presencia de determinadas hormonas vegetales. El resultado de esta etapa es una planta completa que lleva el gen de interés en cada una de sus células.
Una vez obtenida una planta transgénica, para que su cultivo y comercialización sean factibles, deberá presentarse una solicitud ante los organismos reguladores correspondientes que son quiénes determinarán la realización de los ensayos necesarios para el estudio de la bioseguridad ambiental y alimentaria y los efectos de
su comercialización y, en última instancia, darán o no la aprobación del cultivo transgénico (ver Cuaderno Nº 10, 19, y 62).

 

 

 
 

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